Technologie génétique

Abstrait

Caractérisation des domaines protéiques monomériques qui se lient spécifiquement à une cible d'ADN hautement conservée de 100 pb dans les gènes d'ARNr

Elodie Carnus, Marie-Véronique Demattei, Sophie Casteret, Guillaume Carpentier, Fabien Palazzoli, Solenne Bire, Christophe Bressac et Yves Bigot

Des preuves de concept ont montré que les groupes de gènes chromosomiques codant pour l'ARN ribosomique (ARNr) constituent des loci d'intégration de transfert de gènes optimaux pour l'expression du transgène. Cependant, la recombinaison homologue étant efficace pour intégrer des segments d'ADN dans ces gènes chez les animaux, de nouveaux outils moléculaires sont nécessaires pour construire des systèmes capables de cibler des molécules à proximité immédiate des gènes d'ARNr.

 Nous avons étudié les propriétés de plusieurs domaines de liaison à l'ADN (DBD) capables de reconnaître spécifiquement un motif dans une région de 100 pb des gènes d'ARNr qui est conservée à 99-100 % chez les eucaryotes. Nos résultats démontrent que deux DBD de type Myb provenant des endonucléases codées par les rétrotransposons R2 non-LTR sont des candidats prometteurs car ils i) reconnaissent spécifiquement, avec une affinité élevée, un site de liaison de 20 pb situé dans la cible génomique d'ADNr attendue, ii) agissent comme des monomères, iii) contiennent un signal de localisation nucléaire, iv) restent fonctionnels lorsqu'ils sont fusionnés à un autre domaine et, v) n'altèrent pas la fonctionnalité de la protéine à laquelle ils sont fusionnés. Cependant, les résultats obtenus in vivo avec plusieurs fusions R2DBD révèlent que deux propriétés restent à concevoir avant que ces DBD puissent être intégrés dans un système de ciblage moléculaire dirigé vers les gènes d'ARNr. La première concerne la capacité de R2DBD à se localiser dans le nucléole, l'organite dans lequel résident les gènes d'ARNr. La seconde est la tendance de R2DBD à s'accumuler dans certaines parties des noyaux, ce qui limite sa diffusion dans les noyaux. Des solutions sont discutées pour contourner ces limitations actuelles. Nos résultats fournissent des informations importantes concernant les propriétés de R2DBD et le ciblage de l'ADN plasmidique dans les noyaux. Ils devront être analysés plus en détail sous trois aspects : les avantages inexploités des R2DBD, les possibilités et les limites des peptides de fusion pour cibler les intégrations de vecteurs non viraux et les alternatives aux peptides de fusion pour cibler les vecteurs.