Journal des troubles nutritionnels et de la thérapie

Abstrait

Nutrition clinique 2019 : Les effets du thé kombucha sur l'intégrité intestinale chez la souris - Elaheh Mahmoudi - Université des sciences médicales d'Alborz

Elaheh Mahmoudi

Objectif(s) : Le stress oxydatif est impliqué dans la pathogenèse de l'hyperpnée, un facteur de risque de morbidité et de mortalité cardiovasculaires. Plusieurs études humaines ont montré que les caroténoïdes de la tomate peuvent affecter divers aspects de la santé humaine. Au cours de cette présentation, l'auteur abordera deux questions ??? a) équilibrer la réponse des cellules de la peau à l'irradiation UV et b) la réduction des signes vitaux élevés. a) Plusieurs études humaines ont montré que les caroténoïdes de la tomate peuvent réduire les dommages induits par les UV en réduisant l'érythème et en améliorant l'équilibre entre la production et la dégradation du collagène. Nous avons émis l'hypothèse qu'un mélange de caroténoïdes de tomate aux côtés de polyphénols pourrait donner une meilleure protection cutanée que celle attendue de la somme de leur activité. En effet, nous avons compris que les mélanges de complexe nutritif de tomate (contenant du lycopène) avec de l'extrait de romarin (contenant l'acide polyphénol carnosique) réduisaient de manière synergique les marqueurs inflammatoires et induisaient une activité antioxydante dans les cellules de la peau avant tout pour diminuer la métalloprotéinase matricielle (MMP) et pouvaient ainsi réduire la dégradation du collagène et retarder le vieillissement cutané. b) L'hyperthyroïdie peut être un facteur de risque de morbidité et de mortalité cardiovasculaires. Nous avons effectué une analyse dose-réponse pour déterminer la dose efficace optimale d'un complément de complexe nutritif à base de tomate pour maintenir un signe normal chez les personnes hypertendues. Matériels et méthodes:

Un intestin de type tamis a été persuadé dans deux groupes de jeunes et d'adultes en utilisant du sulfate de sodium dextran dans une boisson pendant sept jours. Auparavant, le fKT a été administré aux souris atteintes de colite et comparé aux animaux normaux et non traités du même âge atteints de colite.

Préparation du thé Kombucha (KT)

Du thé noir (Golestan, Téhéran, Iran) a été ajouté à de l'eau bouillante (1,2 % p/v), mélangé et laissé infuser pendant 10 min. Le thé a ensuite été filtré à travers un tamis stérile et du saccharose (10 %) a été dissous dans le thé. Pour organiser le KT, 200 ml du thé refroidi ont été inoculés avec 3 % p/v de champignon de thé plus 10 % v/v de liquide KT qui avait été préalablement fermenté. La récolte a ensuite été laissée à fermenter par incubation à 28 °C pendant 14 jours. Pour former le KT filtré (fKT), le thé fermenté résultant a été centrifugé à 5000 tr/min pendant 20 min et filtré à l'aide d'un filtre en cellulose de 0,45 µm équipé d'une pompe à air.

Groupes expérimentaux et conception de l'étude

Des souris RMN mâles ont été achetées au Centre d'expérimentation animale de l'Institut Pasteur, à Téhéran, en Iran. Tous les animaux ont été hébergés pendant une semaine avant le début des expériences dans des salles à lumière et température régulées au département des animaux traditionnels de l'Université des sciences médicales d'Alborz. Toutes les expériences ont été autorisées par le groupe éthique local (référence n° Abzums.Rec.1395.51) et réalisées conformément au protocole de soins et d'utilisation des animaux de l'Université des sciences médicales d'Alborz.

Français Les animaux ont été divisés en deux groupes de jeunes et de vieux. Chaque groupe a ensuite été subdivisé en deux groupes (8 dans chacun) comprenant des animaux normaux et des animaux induits par une colite. Comme l'indique la figure, chacun des groupes de jeunes ou d'anciens induits par une colite a été subdivisé en deux sous-groupes, dont les animaux induits par une colite sans traitement et les animaux induits par une colite traités par fKT. L'étude a été réalisée en trois phases. Dans le cadre de l'initiative, une colite induite par le DSS a été découverte chez des souris jeunes (2 mois) et âgées (16 mois) pendant une période de 21 jours au cours de laquelle la perte de poids et donc le score clinique ont été évalués et comparés à ceux des animaux sains du même âge. Dans la deuxième phase, l'effet de l'administration de fKT sur l'analyse de survie et donc le score clinique ont été évalués pendant une période de 21 jours. Après l'achèvement de l'essai clinique de phase I et de l'étude II, des évaluations moléculaires et histologiques ont été réalisées sur des témoins sains jeunes et âgés, sur une colite induite par le DSS et sur une colite induite par le DSS traitée par fKT dans le cadre d'un essai clinique de phase III. Considérant le taux de mortalité et les signes cliniques observés chez les animaux atteints de colite, les animaux à cette phase de l’étude ont été sacrifiés le 14e jour après le début de l’étude.

Induction de la colite

Français La colite a été induite le jour 0 en administrant de l'eau potable contenant 3,5 % (p/v) de sel de sulfate de sodium de dextran (DSS) (40 000 kDa, MP Biomedical, Eschwege, Allemagne) par souris et par jour. Les animaux et les signes cliniques de la maladie ont été surveillés quotidiennement, indiqués par une perte de poids, la présence de sang dans les selles ou autour du rectum et une diarrhée jusqu'au septième jour après l'induction de la colite. La perte de poids a été déterminée en comparant le poids corporel de chaque souris au poids corporel de base et exprimée en pourcentage de perte de poids. Les autres symptômes ont été notés selon le système suggéré précédemment par Siegmund  et al . En bref, les différents signes de consistance des selles ont été notés comme suit : score 0, boulettes bien formées ; score 2, selles pâteuses et semi-formées qui n'adhéraient pas à l'anus ; score 4, selles liquides qui adhéraient à l'anus. Les différents signes de saignement ont été notés comme suit : score 0, pas de sang mesuré à l'aide du système Hemoccult (Beckman Coulter) ; score 2, Hemoccult positif ; score 4, saignement important. Les animaux avec des scores limites ont reçu un demi-score.

Analyse histologique et histopathologique

To perform histological evaluation of the colon, the animals were sacrificed under ether anesthesia after the last treatment with beverage or fKT. Colon was initially flushed with 1x ice-cold phosphate buffered saline (PBS) to get rid of feces completely. Tissue samples of the colon were then removed, fixed in 10% buffered formalin, and processed for paraffin sectioning. Sections of about 5 μm thickness were taken and stained with Hematoxylin and Eosin (H&E). The stained sections were examined with an Olympus cX41 microscope and photographed using an Olympus D330 camera . Damage score ranged from 0 to 4 scale was judged based on: inflammation represented by number and extent of leukocyte infiltration, epithelial defects represented by the severity of injury to the somatic cell layer, crypt atrophy estimated visually for the percent of atrophy within the crypts, edema, polymorphonuclear cells(PMNs) infiltration, and mucosal disruption.

Immunofluorescence studies of ZO-1 and ZO-2 expression

Sections of 5 µm paraffin-embedded colon tissues were prepared from each sample and then dewaxed, hydrated, and incubated in a protein block solution. Subsequently, the sections were incubated with the primary rabbit monoclonal ZO-1 or ZO-2 antibody (diluted 1:100 in 0.01 mol /L PBS; Zo-1: ab214228, Zo-2: ab2273, UK) followed by incubation with a goat anti-rabbit Alexa flour 488 (ab150077, Abcam, Cambridge shire, UK). The images were captured using a DeltaPix fluorescent microscope (Smorum, Denmark) and evaluated independently by two expert pathologists.

Analysis of gene expression by real-time PCR

Total RNA was extracted from ~50 mg of frozen colon tissue using guanidine/phenol solution (reagent lysis Qiazol-USA) consistent with the manufacturer’s instruction. the standard and quantity of RNA concentrations were monitored employing a NanoDrop 2000c (Eppendorf, Germany). Then, 1 μg RNA was reversely transcribed to DNA using Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Munich, Germany), consistent with the manufacturer’s instructions. The relative expression of mRNA for GAPDH, ZO-1, and ZO-2 decided by preparing reaction mixer with PCR Master Mix (2X) (Amplicon-Denmark) and gene-specific primers with diluted cDNA and final volume made up to 10 μl with nuclease-free water. Quantification and analysis were administered in ABI real-time PCR. The sequences of primers, designed by Integrated DNA Technologies, were forward 5′-TGTCCCACTTGAATCCCC-3′ and reverse 5′-TGTTTCCTCCATTGCTGTG-3′ for ZO-1 and forward 5′-CTCCCTCTTCACATCTGCTTC-3′ and reverse R: 5′-CTGTTACTTGCTTTGGTCTGG-3′ for ZO-2. The efficiencies for primers utilized in the study varied between 95% and 105%. Primer pairs were validated to make sure the right size of the PCR product and therefore the absence of primer dimers. The GAPDH gene was chosen as an indoor control against which mRNA expression of the target gene was normalized. The resultant organic phenomenon level was presented as 2-ΔCt, during which ΔCt was the difference between Ct values of the target gene and GAPDH.

Statistical analysis

Statistical analysis was performed using Graph Pad Prism 7.01. Data are presented as means± SD. ANOVA was wont to indicate any significant difference between the groups. Survival rates were illustrated using Kaplan–Meier plots and compared using the log-rank test. Value of P was considered statistically significant when it had been but 0.05.

Results:

Characteristics and clinical course of DSS-induced colitis

La colite induite par le DSS chez la souris est le modèle animal le plus courant pour traiter la pathogénèse de la colite et évaluer les approches thérapeutiques. Ce modèle a été découvert dans notre laboratoire et suivi pendant une période de 21 jours (Phase I). Pour ce faire, des souris RMN mâles ont reçu 3,5 % de DSS dans une boisson pendant sept jours. Les animaux ont été contrôlés quotidiennement pendant toute la durée de l'étude pour déterminer leur taux de survie, leur perte de poids et leurs signes cliniques de colite, notamment les saignements et la diarrhée, et ont été comparés aux animaux sains du même âge. Français L'analyse de survie des jeunes animaux traités au DSS a démontré que 66 % et 33 % des animaux étaient en vie les jours 7 et 14, respectivement, et tous étaient morts le jour 2. Juste dans le cas des vieux animaux traités au DSS, l'analyse de survie a révélé que 66 % et 50 % des animaux étaient en vie les jours 7 et 14, respectivement, et tous étaient morts le jour 21. Il y a eu une grande perte de poids dans les groupes jeunes et vieux traités au DSS par rapport aux animaux sains du même âge. Les jeunes souris traitées au DSS avaient perdu environ 10 % et 46 % de leur poids les jours 7 et 14, respectivement. Les vieilles souris traitées au DSS avaient perdu environ 13,5 % et 15 % de leur poids les jours 7 et 14, respectivement. En ce qui concerne les signes de troubles digestifs, des saignements et une diarrhée ont été observés chez les jeunes et les vieilles souris traitées au DSS les jours 2 et 3 après l'administration de DSS, respectivement. Ces résultats démontrent que les jeunes souris traitées au DSS présentent des signes cliniques plus graves et un taux de survie plus faible que les vieilles souris traitées au DSS.

Observations histologiques

L'analyse histologique des coupes de tissus colorées à l'H&E (Figure 6) de toutes les souris jeunes et âgées soumises au DSS a montré une infiltration accrue de PMN, une perte cryptique, un défaut épithélial, une rupture de la muqueuse, une apoptose, un œdème et une minceur de la muqueuse par rapport aux souris saines du même âge. Le traitement par fKT a diminué l'étendue des lésions, bien qu'il n'ait pas entraîné un retour complet à l'état de santé par le régime administré au cours de cette étude. Notamment, les souris âgées en bonne santé présentaient plus d'infiltration de PMN, de perte cryptique et d'œdème que les jeunes animaux en bonne santé. Comme le montre la Figure 6c, l'épaisseur de la muqueuse a diminué par l'administration de DSS car le score clinique a augmenté chez les jeunes et les personnes âgées atteintes de colite induite par le DSS. Ce travail est en partie présenté lors de ^la 24e  Conférence internationale sur la nutrition clinique , du 4 au 6 mars 2019, qui s'est tenue à Barcelone, en Espagne.