Journal mondial de la biologie, de l'agriculture et des sciences de la santé

Abstrait

Conception, optimisation et validation d'un test de cytométrie de flux pour la quantification des Igg-anti-D (rho) dans le contrôle du processus industriel de production d'anti rho-gamma globuline

Sergio A Oviedo, Susana Vitali, Jorge Zarzur

L'une des principales causes de la maladie hémolytique du nouveau-né est due à la génération d'anticorps anti-D, en réponse à un défi antigénique continu chez les mères enceintes qui ne possèdent pas l'antigène D dans leurs globules rouges. Afin de prévenir les complications, la surveillance des niveaux d'anticorps anti-D chez les femmes enceintes est effectuée et la sensibilisation est évitée par une prophylaxie avec des immunoglobulines anti-D (IgG anti-D). À ce jour, la surveillance et le titrage de l'anti-D dans le plasma et les produits finis (IgG anti-D) sont effectués par analyse en flux continu avec un auto-analyseur Technicon, un dosage radio-immunologique (RIA) et un dosage enzymatique immuno-immunologique (EIA). Dans notre laboratoire, pour la quantification des anticorps anti-D de l'UNC Gamma-Rho et des produits du processus d'élaboration, une technique "maison" de cytométrie en flux a été développée comme test alternatif à la méthode de référence de la Pharmacopée européenne. Des anticorps polyclonaux anti-Rho et une IgG humaine marquée au FITC (isothiocyanate de fluorescéine) ont été utilisés pour mesurer la concentration d'anticorps anti-D dans une préparation commerciale de gammaglobuline, de plasma semi-transformé et de plasma humain. La méthode a été développée en utilisant la première norme internationale de l'OMS pour les IgG anti-D (69/419). À la concentration d'hématies utilisée dans la méthode (5 x 104 cellules/ul), il n'y a pas d'interférence par auto-agglutination. La courbe dose-réponse obtenue (MFI vs. Log C) était linéaire dans la plage de travail adoptée, présentant un coefficient de corrélation de 0,99. Les tests de spécificité et de récupération étaient satisfaisants, les contrôles négatifs ont montré des niveaux de fluorescence insignifiants et n'ont pas présenté d'interférence sérieuse dans la détermination. Sachant que les taux d'antigènes anti-sites D par globule rouge, varient selon le phénotype, nos résultats montrent que les globules de phénotypes R1R1 présentent les meilleures performances pour ce test, et peuvent être remplacés si nécessaire par des cellules R1R2. La méthode a été validée suivant les critères du groupe d'experts N°6B du NIBSC et de la Pharmacopée européenne qui ont standardisé une procédure similaire à appliquer dans l'évaluation des anti-D. La cytométrie en flux a permis d'obtenir des déterminations exactes, précises, sensibles et spécifiques à différentes concentrations d'anti-D (100-0,9 ug/ml) et dans différentes matrices biologiques telles que le produit fini, le produit concentré prérempli et la fraction II de la méthode de Cohn. Les avantages trouvés dans l'application de cette méthode, en plus du coût relativement faible, comprennent un signal de fluorescence fort qui ne nécessite pas d'amplification, l'utilisation d'échantillons hautement dilués qui minimisent le risque d'agglutination par IgM-Anti D ou polymères. C'est une méthode simple, rapide et fiable pour déterminer les taux sériques d'anti-D ou quantifier la concentration dans une solution d'immunoglobuline.