Journal de recherche et de thérapie sur les cellules souches

Abstrait

Microdissection par capture laser de cellules interzones murines : sélection des couches et prédiction du rendement en ARN

Florien Jenner, Gerjo JVM van Osch, Mairead Cleary, Iris Ribitsch, Ulrich Sauer, René van Weeren et Pieter Brama

Objectif : Les chondrocytes articulaires proviennent d'une cohorte distincte de cellules progénitrices situées dans la zone dite interzone des articulations en développement embryonnaire. Nous avons mené cette étude 1) pour déterminer s'il est possible d'identifier les couches interzones intermédiaires et externes histologiquement (en utilisant du violet de crésyle) sans hybridation in situ ou immunohistochimie auxiliaire ; 2) pour établir si des quantités suffisantes d'ARN peuvent être récoltées à partir de chaque couche interzone d'embryons individuels pour permettre l'analyse de l'expression génétique ; 3) pour développer des mesures qui peuvent fournir une estimation du rendement en ARN avant des étapes d'amplification coûteuses. Méthodes : Les cellules de la zone interzone externe (OI) et intermédiaire (II) de l'articulation fémoro-tibiale naissante et du cartilage épiphysaire (EC) du fémur et du tibia d'embryons murins de 13,5 et 15,5 jours de gestation ont été récoltées à l'aide d'une microdissection par capture laser (LCM). Par la suite, une analyse par microarray a été réalisée pour confirmer la sélection appropriée de la couche. Français La surface récoltée et la valeur de gris (gv) des photomicrographies prises pendant la LCM ont été mesurées et la densité optique relative (ROD) correspondante a été calculée et le degré et la signification de la corrélation avec le rendement en ARN ont été déterminés. Résultats : Les cellules de l'OI, II et EC ont pu être identifiées histologiquement à l'aide d'une coloration au violet de crésyle et ont été récoltées avec succès avec la LCM produisant des quantités suffisantes d'ARN pour l'amplification linéaire et l'analyse par microarray. Le rendement en ARN était significativement corrélé à la surface tissulaire récoltée, au gv moyen et au ROD correspondant. Conclusions : Cette étude fournit une technique de microdissection sélective par capture laser et d'analyse ultérieure par microarray des cellules interzones murines de la couche intermédiaire et externe et présente une méthode pour estimer le rendement en ARN en mesurant la surface tissulaire récoltée et en calculant le ROD. Nous recommandons de récolter un minimum de 1 × 106 μm2 d'embryons murins de 13,5 jours et 3 × 106 μm2 d'embryons murins de 15,5 jours pour obtenir environ 10 ng d'ARN total qui peut être utilisé pour l'amplification linéaire basée sur T7 et l'analyse ultérieure par microarray.