Journal de pathologie végétale et de microbiologie

Abstrait

Détection spécifique de Klebsiella variicola et K. oxytoca par amplification isotherme à médiation par boucle

Jarred Yasuhara-Bell, Caleb Ayin, April Hatada, Yonghoon Yoo, Robert L. Schlub et Anne M. Alvarez

Les Klebsiella spp. sont des agents pathogènes opportunistes dont les isolats cliniques, vétérinaires et associés aux plantes sont présents. Une étude précédente a montré que l'exsudat bactérien provenant du bois humide d'arbres de bois de fer gravement dépérissants à Guam contenait Ralstonia solanacearum , Klebsiella variicola et K. oxytoca. Dans cette étude, l'amplification isotherme à médiation par boucle (LAMP) a détecté spécifiquement K. variicola et K. oxytoca, en utilisant des ensembles d'amorces uniques conçus individuellement pour chaque organisme. Chaque LAMP a détecté spécifiquement sa cible, tout en montrant des résultats négatifs pour les bactéries non ciblées et les témoins négatifs. LAMP a détecté Klebsiella dans les tissus de tige de bois de fer inoculés et dans l'exsudat bactérien. En raison de la présence d'inhibiteurs végétaux, différents protocoles d'échantillonnage ont été testés. Le trempage des échantillons de tissus végétaux pour permettre la diffusion des bactéries dans la solution, suivi de l'ébullition, a permis une détection optimale de Klebsiella directement à partir d'échantillons végétaux. Les faux négatifs obtenus lors de l'utilisation d'échantillons de plantes broyées ont été éliminés en incluant une étape d'enrichissement, impliquant un placage et une incubation de 12 heures. L'électrophorèse sur gel à gradient dénaturant (DGGE) et un immuno-essai de transfert de colonies utilisant un anticorps spécifique de Klebsiella ont également détecté Klebsiella dans le bois de fer inoculé. Les bandes DGGE et les réactions croisées d'anticorps d'entérobactéries étroitement apparentées ont montré le potentiel de résultats faussement positifs. La nature de LAMP le rend idéal pour les tests au point de service et, lorsqu'il est combiné à la spécificité des amorces LAMP développées dans cette étude, démontre son potentiel en tant que test de terrain de routine pour Klebsiella dans le bois de fer à Guam, ainsi que pour le diagnostic clinique et vétérinaire de l'infection à Klebsiella. De plus, les régions ciblées pour la détection dans cette étude ont une application dans toutes les formes de diagnostic moléculaire.