Journal de la technologie microbienne et biochimique

Abstrait

Effets des prétraitements sur la détection des bactéries par qPCR - Indicateur bactérien, Enterococcus comme modèle

Shin Giek Goh et Karina Yew-Hoong Gin

Les directives actuelles sur les eaux récréatives (par exemple, l'USEPA et l'OMS) recommandent les entérocoques comme indicateur pour les eaux douces et marines. La méthode basée sur la culture est utilisée depuis des décennies pour quantifier la présence d'entérocoques. En 2012, la directive de l'USEPA pour les eaux récréatives a inclus la qPCR comme méthode alternative pour détecter les entérocoques. La méthode qPCR ne nécessite pas un temps d'incubation aussi long que la méthode basée sur la culture. De plus, elle offre les avantages d'une détection à haute précision et sensibilité. Néanmoins, la qPCR est entravée par trois principaux facteurs limitatifs. Il y a un nombre limité de cellules cibles dans un petit volume d'échantillon analysé par qPCR, la présence d'inhibiteurs qui peuvent facilement affecter la détection sensible de la qPCR et la persistance d'ADN libre (ADN libéré par les cellules mortes) qui a provoqué le signal faussement positif dans la qPCR. En tant que tels, les traitements en amont sont essentiels à la précision de la détection qPCR. Trois méthodes de pré-concentration différentes (i) filtration avec membrane en nylon ; (ii) filtration avec membrane en polycarbonate et (ii) centrifugation, ont été examinées pour leur taux de récupération. La filtration avec une membrane en polycarbonate s'est avérée donner des résultats d'efficacité de récupération et de cohérence plus élevés, quels sont les matrices d'échantillon. L'extraction d'ADN conventionnelle et deux kits d'extraction d'ADN disponibles dans le commerce ont été évalués en fonction de la pureté de l'ADN extrait et de l'efficacité de récupération relative de l'extraction. Les résultats montrent que le kit commercial, QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen), a donné les meilleures performances. L'application de membranes de silice dans le kit QIAamp® DNA Mini s'est avérée améliorer la récupération de l'ADN avec une interférence minimale des inhibiteurs. Le monoazide d'éthidium (EMA) et le monoazide de propidium (PMA) ont été évalués pour leur performance dans la réduction du signal faussement positif dans la qPCR. Le PMA semble offrir une meilleure option pour réduire la détection faussement positive de l'ADN dans une cellule dont la membrane est compromise.