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Abstrait
Utilisation du modèle cellulaire E18 pour quantifier l'effet témoin associé à la rupture de brin d'ADN (DSB-ABE)
Jalal Nasir
La lignée cellulaire lymphoblastique E18 est un dérivé de TK6 et possède un insert I-Sce1 dans l'intron 2 du gène hétérozygote TK1 / tk1 . E18 peut être ciblé avec l'endonucléase de restriction I-Sce1 pour induire des cassures double brin au site I-Sce1 afin de mesurer les dommages à l'ADN indépendants du rayonnement et l'effet bystander associé. Pour la construction de la lignée cellulaire E18, un site Eco47III a été inséré dans le squelette plasmidique linéarisé pTK-UAS et recuit avec des oligonucléotides à extrémités franches de la séquence de restriction ISce1 en présence d'ADN ligase. Les cellules DH5-α ont été transformées par transfection thermique des cellules avec pTK-UAS-Eco47III-Sce1 et sélection de colonies résistantes à l'ampicilline. L'ADN plasmidique a été extrait et analysé pour la présence des sites Eco47III et I-Sce1. Un clone avec le site I-Sce dans l'intron 2 de l'allèle actif de la thymidine kinase a été sélectionné pour des expériences supplémentaires et nommé E18. Ce modèle a été testé pour démontrer les mutations induites par la cassure du double brin et ces cassures de brin peuvent également produire un effet de voisinage associé à la cassure du brin d'ADN (DSB-ABE) tel que mesuré par une fréquence de mutation accrue dans les cellules naïves. Le plasmide pAdTrackCMV I-Sce1 portant le marqueur GFP a été électroporé dans des cellules E18 pour exprimer l'endonucléase de restriction I-Sce1 qui cible spécifiquement le site I-Sce1 à l'intron 2 de l'allèle TK actif. Le test de fraction de mutation a été utilisé pour mesurer la fraction de mutation directe (DMF) ou accompagné d'un transfert de milieu conditionné vers des cellules naïves pour mesurer la fraction de mutation de voisinage (BMF) comme point final du ciblage de E18 avec une expression exogène d'I-Sce1 via pAdTrackCMV I-Sce1 pour induire des dommages à l'ADN et quantifier la DMF et la BMF.