Biochimie & Biochimie Analytique

Abstrait

Congrès Biotechnologie 2015 : Cystéine chimiquement modifiée dans les procédés fed-batch et impact sur la productivité spécifique de CHO - Aline Zimmer Merck Millipore

Aline Zimmer

La culture industrielle de cellules de mammifères en mode fed-batch est utilisée pour la production de protéines thérapeutiques telles que les anticorps monoclonaux. Outre le milieu assurant la croissance initiale, l'alimentation est nécessaire pour améliorer la croissance, la viabilité et la production d'anticorps. Les systèmes commerciaux établis comprennent une alimentation principale concentrée légèrement acide et une alimentation séparée en acides aminés alcalins contenant de la L-tyrosine et de la L-cystéine. Étant donné que la L-cystéine n'est pas stable en raison de sa dimérisation en cystéine en présence d'air et de catalyseurs métalliques, un dérivé stable de la L-cystéine est nécessaire pour inclure tous les acides aminés dans les aliments à pH neutre. Ces systèmes d'alimentation unique sont privilégiés pour simplifier les schémas d'alimentation et améliorer la robustesse globale du processus grâce à la stabilisation des signaux de pH et d'OD. Ici, nous suggérons l'utilisation d'une cystéine chimiquement modifiée en combinaison avec du sel disodique de phosphore tyrosine dans un procédé industriel en mode fed-batch à alimentation unique applicable à petite échelle ainsi que dans les bioréacteurs. Les expériences de culture cellulaire ont été réalisées soit dans des tubes à centrifuger, soit dans des bioréacteurs avec une lignée cellulaire en suspension CHO exprimant un anticorps monoclonal humain. La densité et la viabilité des cellules viables ont été mesurées à l'aide d'un dispositif de comptage automatique des cellules. L'analyse des milieux usagés des surnageants a été réalisée pour les acides aminés après dérivatisation pré-colonne et analyse UPLC et pour les vitamines à l'aide de LC-MS/MS.

Les mesures des métabolites ont été réalisées avec Cedex Bio HT en s'appuyant sur des méthodes photométriques et turbidométriques. La caractérisation de l'anticorps monoclonal a été réalisée en utilisant le marquage 2-AB pour les analyses de glycanes, le cIEF pour les analyses de variantes de charge et la LC-MS/MS pour les expériences de cartographie des peptides. Les études de stabilité de l'aliment contenant le dérivé de cystéine modifié ont montré que la molécule était stable et qu'aucune L-cystéine ou L-cystine n'était libérée pendant trois mois lorsqu'elle était stockée à température ambiante ou à 4 °C. De plus, aucun changement de couleur de l'aliment n'a été observé au fil du temps. Des expériences par lots à petite échelle où la L-cystéine a été remplacée par la même quantité de cystéine chimiquement modifiée n'ont indiqué aucun changement dans les profils de croissance ou de viabilité. L'utilisation du dérivé de cystéine modifié dans des processus à petite échelle en lots alimentés a indiqué une densité cellulaire maximale viable comparable, une viabilité prolongée et un titre accru par rapport au système à deux aliments établi.

Les expériences en bioréacteur ont confirmé l'augmentation de la productivité spécifique décrite à petite échelle lorsque la stratégie d'alimentation unique a été comparée à la stratégie d'alimentation à deux. Une caractérisation approfondie de l'anticorps monoclonal n'a indiqué aucun changement dans le schéma de glycosylation ou de variation de charge tandis que les expériences de cartographie des peptides n'ont pas pu détecter d'intégration de l'acide aminé modifié dans la séquence de l'anticorps monoclonal. Les formes d'agrégats prises en charge par les mammifères pour la création de neutralisants monoclonaux (mAb) dépendent de la prise en charge vitale de quelques suppléments, par exemple le glucose, les nutriments et les acides aminés pour augmenter le temps de culture et améliorer la production de protéines[1]. Dans les procédures réelles, la L-cystéine et la L-tyrosine sont prises en charge indépendamment à pH soluble en raison de leur faible stabilité et de leur faible solvabilité à pH neutre, ce qui entraîne des pics de pH et des précipitations[2]. Pour améliorer les formes de pointe, les deux acides aminés ont été artificiellement modifiés pour améliorer leurs profils de solidité et de dissolvabilité particuliers. Des travaux antérieurs ont montré que le sel disodique de phosphotyrosine (PTyr2Na) est un dérivé stable de la L-tyrosine et peut être utilisé dans des solutions de pH neutres sans affecter de manière détectable les performances du mode de vie ou les caractéristiques de qualité des mAb[3]. Nous présentons ici les résultats obtenus en utilisant un dérivé de la L-cystéine dans un cadre à pH neutre et à alimentation unique.

La fiabilité de l'aliquote de L-cystéine a été évaluée dans un pH neutre, CellventoTM Feed-220 pendant un trimestre à température ambiante ou 4°C. Pour les groupes de cultures traités, un clone CHO K1 transmettant un mAb humain a été utilisé. La croissance a été réalisée dans le cadre du milieu Cellvento™ CHO-220 comme indiqué dans les instructions de la procédure de l'article. Pour les contrôles, Cellvento™ Feed-220 et un autre aliment basique cystéine/tyrosine ont été utilisés, bien que dans le processus d'alimentation unique, l'aliquote de L-cystéine et PTyr2Na aient été directement solubilisés dans l'aliment primaire à pH neutre. Les essais ont été réalisés dans des tubes à essai et des bioréacteurs de 1,2 L. La croissance et la fiabilité ont été observées à l'aide d'un ViCell®, le titre a été déterminé à l'aide de Cedex Bio HT et la rentabilité spécifique a été déterminée en fonction du titre, de l'épaisseur cellulaire potentielle vitale et de l'affaiblissement.

Pour l'analyse des milieux usés, la mesure de la L-cystéine subsidiaire et de l'acide amino-corrosif a été réalisée par UPLC à l'aide du réactif AccQ·TagTMUltra. Pour évaluer la capacité de réponse de l'aliment, du H2DCFDA a été ajouté au pH neutre, Cellvento™ Feed-220 a été amélioré ou non avec le subordonné. Pour l'évaluation des espèces réactives intracellulaires, les cellules ont été marquées avec du carboxy-H2DCFDA et la fluorescence a été estimée. Pour évaluer la limite des cellules à utiliser le subsidiaire, les lysats cellulaires ont été enrichis et les éléments formés ont été évalués par UPLC. Pour l'analyse des mAb, la N-glycosylation a été mesurée par HPLC après marquage 2-AB, tandis que les variations de charge ont été résolues par cIEF.

L'étude de l'équilibre de la L-cystéine dans une alimentation à pH neutre n'a montré aucun changement dans la fixation de la L-cystéine ou dans la libération de L-cystine lorsqu'elle était conservée pendant plus d'un trimestre à température ambiante ou à 4°C. Aucune précipitation ou changement de couleur n'a été observé, ce qui montre que la L-cystéine était stable dans les conditions testées. La croissance des grappes traitées dans des tubes à essai avec la procédure d'alimentation unique a entraîné des viabilités finales plus élevées, ce qui a conduit à des titres finaux améliorés par rapport à la condition témoin. Les résultats des tubes à essai ont été confirmés dans des bioréacteurs, ce qui a conduit à des viabilités finales plus élevées, à des titres accrus et à une rentabilité explicite plus élevée avec la méthodologie d'alimentation unique.

Une oxydation de couleur plus faible a été estimée après l'expansion du H2DCFDA à un pH neutre, Cellvento™ Feed-220 contenant le dérivé par rapport à l'alimentation seule montrant un potentiel réceptif plus faible. Une oxydation de couleur intracellulaire plus faible a été identifiée par l'expansion du carboxy-H2DCFDA pour transformer les sociétés de groupes à alimentation unique en tube présentant un âge d'espèces réceptives intracellulaires inférieur lors de l'utilisation du dérivé. Une fois ajouté aux lysats cellulaires, le dérivé de cystéine a été utilisé en cystéine. Aucune différence dans la N-glycosylation ou la variation de charge n'a été identifiée dans le mAb délivré, démontrant l'absence d'impact du dérivé sur les caractéristiques de qualité basique introduites. Cette étude montre que le dérivé de L-cystéine et PTyr2Na peuvent être incorporés dans un pH neutre et peuvent être utilisés comme source de L-cystéine dans des formes de groupes traitées, ce qui conduit à une efficacité spécifique plus élevée par rapport au processus le plus performant sans affecter les propriétés de qualité basique du mAb.