Biochimie & Biochimie Analytique

Abstrait

Utilisation de la dichlorofluorescéine comme sonde pour surveiller les effets du calcium sur la production de ROS dans les mitochondries

Olga V Akopova, Liudmila Kolchinskaya et Valentina Nosar

La dichlorofluorescéine (DCF) est largement utilisée pour surveiller la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les cellules et les mitochondries isolées. Notre objectif était de comparer différentes approches d'utilisation de la DCF pour surveiller la formation d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) accompagnant le transport de Ca2+ dans les mitochondries isolées. Les effets du Ca2+ sur la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) ont été étudiés dans les mitochondries du cerveau et du foie de rat en utilisant deux modes d'application de la DCF : le premier était le préchargement d'une suspension mitochondriale de réserve avec du diacétate de dichlorofluorescéine (DCFDA), précurseur de la DCF, et l'autre était l'ajout d'aliquotes de DCFDA directement au milieu d'incubation. Le calcium a augmenté la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les mitochondries du cerveau et du foie à la fois dans des conditions d'équilibre et de non-équilibre causées par la libération progressive du cytochrome c et le blocage du flux d'électrons. En utilisant des mitochondries préchargées en DCF, nous avons montré que le taux de formation de ROS dans des conditions d'état stable dépendait linéairement du taux de cycle du Ca2+ et de la respiration stimulée par le Ca2+. La transition vers un état de non-équilibre a entraîné une augmentation non linéaire de la formation de ROS, qui a également montré une dépendance à la concentration en Ca2+. Alors que dans les mitochondries préchargées en DCF, la fluorescence du DCF suivait de près l'évolution temporelle du transport du Ca2+, dans les mitochondries non chargées, le chargement de la sonde interférait avec la détection de la formation de ROS en raison du changement continu de la concentration en DCF dans l'espace matriciel. Sur la base de ces expériences, nous sommes arrivés à la conclusion que le DCF préchargé dans les mitochondries pourrait servir de sonde appropriée pour surveiller les effets du transport du Ca2+ sur la production de ROS.